Den hellige Barnabas ble født rundt Kristi fødsel på Kypros. Han het egentlig Josef og var jøde av Levis stamme. Han ble oppdratt i den jødiske tro og ble sendt til Jerusalem til den berømte læreren Gamaliel, som også hadde undervist den hellige apostelen Paulus. I følge Apostlenes gjerninger var han «en prektig mann, full av hellig Ånd og tro» (Apg 11,24). Da han solgte sine eiendeler, inkludert gården han arvet etter foreldrene, for å slutte seg til den første kristne menigheten i Jerusalem, ga apostlene ham navnet Barnabas, som betyr «Trøstens sønn» (Apg 4,36) (denne betydningen er filologisk tvilsom). Han kalles apostel selv om han ikke var en av de tolv. Denne tittelen ble brukt av de tidlige fedre og av evangelisten Lukas på grunn av sitt apostoliske arbeid og det oppdrag apostlene ga ham.
Barnabas tok seg av den nyomvendte Paulus, som han kjente fra før, da han kom til Jerusalem og de andre disiplene var skeptiske til denne tidligere forfølgeren, og Barnabas huskes best for sitt tette samarbeid med Paulus. Det var Barnabas som ble sendt til den voksende kristne menighet i Antiokia, og han fikk Paulus fra Tarsus til å hjelpe seg. Her var det første gang tilhengerne av Kristus ble kalt «kristne» (Apg 11,22-30). Barnabas og Paulus ble i Antiokia i ett år.
Antiokia var en rik by, og da de kristne der hørte at det hersket hungersnød i Judea, samlet de sammen penger for å hjelpe sine medkristne. Barnabas og Paulus ble sendt tilbake til Jerusalem med pengene. Det var der de møtte Barnabas' slektning (fetter eller nevø) Markus (som kan være identisk med evangelisten Markus), som skulle slutte seg til dem i deres misjon (Apg 12,25). De tre vendte tilbake til Antiokia, hvor lærerne, inspirert av Den Hellige Ånd (Apg 13,2) besluttet å sende dem til Kypros på deres første misjonsreise.
De gikk i land i den store gresk-romerske byen Salamis helt i nordøst, og deretter reiste de over hele øya. I Paphos konfronterte de den falske profeten Bar-Jesus og omvendte den romerske prokonsulen Sergius Paulus. Barnabas anses for grunnleggeren av Kirken på Kypros.
Markus reiste tilbake til Jerusalem, men Paulus og Barnabas fortsatte sitt arbeid sammen i Lilleasia. Deres vanlige skikk var å dra til en by og forkynne i synagogen – og de må ha vært fullstendig klar over at de kunne komme til å lide den hellige martyren Stefans skjebne for denne direkte konfrontasjonen med ortodoks jødedom. I Lystra, der Paulus hadde helbredet en syk mann, trodde den hedenske befolkningen at Zevs og Hermes hadde steget ned fra Olympen og kom med en blomsterprydet okse for å ofre for dem. Med nød og neppe lyktes det Paulus og Barnabas å forhindre dette. Den kortvokste og uanselige Paulus hadde de tildelt rollen som Zevs, og det at Barnabas ble ansett for å være Hermes, viser at han var høyreist og statelig (Apg 14,8-20).
De hadde stor suksess i begynnelsen og fikk mange tilhengere, men så led de nesten Stefans skjebne da deres motstandere blant jødene samlet seg for å steine dem. Paulus ble alvorlig såret, og de måtte forlate byen i all hast. Dette mønsteret ble gjentatt i andre byer hvor det kristne budskapet brakte uenighet og konflikt, men de omvendte sto fast. Da Paulus og Barnabas hadde nådd Derbe, hvor de hadde omvendt mange, snudde de og dro tilbake samme vei, og de utnevnte og ordinerte presbytere. Deretter vendte de tilbake til Antiokia rundt 49, «fulle av glede og Den Hellige Ånd» (Apg 14).
De deltok på apostelkonsilet i Jerusalem i 51, hvor det ble diskutert om de hedningekristne skulle omskjæres og læres opp i Moseloven, og de avgjorde spørsmålet om jødekristne og hedningekristne gjennom sine erfaringer som hedningemisjonærer. Da Paulus dro ut på sin andre misjonsreise, skilte de to lag. Det skjedde etter at Paulus hadde en uoverensstemmelse med Markus – han ville ikke ha ham med på den neste reisen fordi han hadde reist fra dem i Pamfylia på den første. Barnabas prøvde å megle, men stilte seg til slutt på Markus' side. Paulus tok med seg Silas i stedet, mens Barnabas tok Markus med tilbake til Kypros (Apg 15,36-40).
Som hjemstedets første biskop befestet han troen der på den oppstandne Kristus. Deretter hører vi lite mer om ham. Da Paulus skrev sitt første brev til menigheten i Korint, kommer det klart frem at Barnabas i 56 eller 57 fortsatt levde og virket der og de to var blitt forsonet: «Er Barnabas og jeg de eneste som ikke har rett til å la være å arbeide for vårt underhold?» (1.Kor 9,5-6). Da Paulus var fange i Roma i 60 eller 61, ba han Markus om å dra til ham, noe som antyder at Barnabas da var død.
Det Nye Testamente forteller ingenting om Barnabas' død, men legenden sier at han led martyrdøden i år 61 ved å bli steinet av jødene i Salamis ved Famagusta på Kypros. Syriske kilder hevder at han døde på øya Samos. Greske kilder sier at han dro til Roma, misjonerte i Italia og til slutt ble steinet på Kypros. Han knyttes også til Alexandria. Noen bemerkninger fra Paulus i brevene til Galaterne og Korinterne antyder at Barnabas' apostolat strakte seg ut over Kypros, men tradisjonen at han var Milanos første biskop, er usannsynlig.
En annen kilde hevder at han ble fanget av jødene på Kypros; med et rep om halsen ble han slept ut av byen og brent. Han skal ha blitt gravlagt av Markus nær Salamis med Matteusevangeliet på brystet i en avskrift han selv hadde skrevet. I 482 fant man igjen hans grav, og på de jordiske rester av apostelen lå evangelieboken. Den ble sendt til keiser Zeno (474-91) i Konstantinopel. Hans relikvier kom også til Konstantinopel, hvor det ble bygd en kirke til hans ære. Flere italienske byer har relikvier, og også Köln, Andechs, Praha, Toulouse og Namur.
Apostelen blir fremstilt med Evangeliet i hånden og en stein som tegn på sitt martyrium. Han fremstilles også med en oljegren, ofte sammen med Paulus. Han finnes ofte på venetianske malerier på grunn av sitt slektskap med Markus, Venezias skytshelgen. Det såkalte «Barnabas' brev» er ikke skrevet av ham, i dag er det allment akseptert at det er skrevet av en kristen i Alexandria mellom år 70 og 100. «Barnabas' evangelium» ble trolig skrevet av en italiensk kristen som ble muslim. Boken «Barnabas' gjerninger», som man en gang trodde var skrevet av Markus, er nå tidfestet til 400-tallet.
Noen, som for eksempel Tertullian, mener at Barnabas skrev Brevet til Hebreerne. Barnabas var en av De apostoliske fedre, en gruppe hellige som levde mellom år 60 og 150 og var blant apostlenes disipler. En relativt sen tradisjon, nevnt av den hellige Klemens av Alexandria, sier at Barnabas var blant Jesu 70 (72) disipler. Han står som nr. 6 på biskop Dorotheus av Tyrus liste over «Jesu Sytti disipler» i henhold til Den ortodokse kirkes tradisjon. Den berømte kirkehistorikeren Eusebius av Caesarea (ca 260-340) sier at det ikke eksisterte noen slik liste på hans tid, og han nevnte blant de 70 bare Barnabas, Sostenes, Kefas, Matthias, Thaddeus og Jakob «Herrens bror» (Historia Ecclesiae I.xii).
Barnabas' minnedag er 11. juni. Den ble feiret på denne dato både i øst og vest fra 800-tallet. I øst minnes han den 11. april. Han nevnes i Canon Romanus eller Den romerske kanon (Eukaristisk bønn I). Barnabittene, en orden som ble stiftet av den hellige Antonius Zaccaria i Milano i 1530, tok sitt navn fra sin hovedkirke, som var viet til Barnabas, antatt å ha vært Milanos første biskop. Tradisjonen med å påkalle ham mot haglstormer, kommer trolig av at han ble martyrdrept ved å bli steinet.