Den hellige Agnes er utvilsomt en av de mest berømte jomfrumartyrene fra den tidlige Kirken, og i hvert fall den best dokumenterte av dem som døde i Roma, men likevel er det lite vi med sikkerhet vet om henne. Man mener at hun døde i de siste ukene av kristenforfølgelsene under keiser Diokletian (284-305), som startet med et edikt i februar 303 og varte i mindre enn to år. Den tradisjonelle datoen for hennes martyrium er 21. januar, så året var trolig 305.
Det er ingen tvil om at hun led martyrdøden i Roma og ble gravlagt på kirkegården ved Via Nomentana. Hennes foreldre må ha vært velstående, for de bygde en marmorgrav for henne på et gravsted som tilhørte familien. Da keiser Konstantin I den Store (306-37) ønsket å døpe sin datter Konstantia, gjorde han det på dette stedet. Konstantia bygde en basilika over Agnes' grav i år 350, Sant'Agnese fuori le Mura, som fortsatt står, men er betydelig ombygd. Gruppen av bygninger på dette stedet er av spesiell historisk og kunstnerisk interesse. I apsis er det en akostrikon-inskripsjon, som ganske enkelt sier at Agnes var «jomfru» og «seierrik». Et annet bevis på en tidlig kult er et gullmalt glass, som ble funnet i Panfilo-katakomben i Roma og stammer fra 300-tallet.
Agnes' navn og festdag opptrer i martyrologiet Depositio Martyrum fra 354 og de tidlige romerske sakramentariene. Siden er det skrevet mye om henne, blant annet nevner den hellige pave Damasus I (366-84) henne i sine berømte gravskrifter Epigrammata. Den hellige Ambrosius beskrev hennes martyrium i en preken, som senere ble revidert for å utgis i De virginibus (377), og han skrev også en hymne til hennes ære, Agnes beatae virginis. Andre som priser henne, er Prudentius og de hellige Hieronymus og Augustin. Både Ambrosius og Augustin er enige om at hun var tretten år gammel da hun ble drept.
Dessverre er det tydelig fra de mange motstridende opplysningene i de tidlige overleveringene at overleveringen om Agnes og hennes liv ikke lenger sto veldig klart. Tradisjonene i øst og vest stemmer ikke overens, det er mulig det dreier seg om ulike martyrer ved navn Agnes. Hennes biografi er fra 400-tallet, og som så mange andre er den feilaktig tilskrevet Ambrosius. Det er nå allment akseptert at den ikke kan klassifiseres på linje med tidlige dokumenter som «Polykarps martyrium», «Perpetua og Felicitas' lidelseshistorie» eller «Den hellige Kyprians prekonsulære akter», som alle var skrevet like etter martyrenes død og i noen tilfeller besto av stenografiske beretninger fra avhørsprotokollene. Biografier om helgener som Cecilia og Agnes betraktes som folkelig litteratur som noen ganger bygger på fiksjon.
Et kvalifisert forsøk på å rekonstruere hennes historie ut fra det foreliggende, men utilstrekkelige materialet kan sammenfattes slik:
Agnes er det greske ordet for «kysk». Det er alminnelig enighet om at hun var svært ung, bare tolv eller tretten år. Hvis hennes relikvier i Roma er ekte, noe kompetente arkeologer anser for sannsynlig, bekrefter de hennes alder. Hun nektet å inngå ekteskap og viet i stedet sin jomfruelighet til Gud. Da det brøt ut kristenforfølgelser, forlot hun sitt hjem og overlot seg frivillig til martyriet. Hun motsto alle trusler og ble henrettet ved å få halsen gjennomboret (en vanlig romersk henrettelsesmetode). Legenden utbroderer historien videre:
Den forteller at Agnes var en ung romersk jomfru i en rik familie. Hun var uvanlig vakker, og sønnen til byprefekten Sempronius fridde til henne. Men hun avslo, med den begrunnelse at hun hadde en brudgom i Kristus. Den forsmådde beileren anmeldte henne, og til straff ble hun plassert naken på et bordell. Men Gud lot hennes hår vokse så hurtig at hun ble bedre beskyttet enn med klærne på.
Det fortelles at hun ble kastet på bålet uten at ilden kunne brenne henne. Hun ble torturert med glødende jern, uten at det skadet den fromme piken. Til slutt kuttet bødlene strupen over på henne, og da først døde hun. Åtte dager senere åpenbarte hun seg for de troende, omgitt av hvitkledde jomfruer og med et hvitt lam ved sin side (latin: agnus = lam).
I tillegg er det vokst frem flere tilknyttede tradisjoner, blant annet om at en soldat så på henne naken i bordellet med «urene tanker», og ble straks blindet, han fikk først synet tilbake ved Agnes' bønner. Det fortelles også at den kjærlighetssyke frieren dro til bordellet og ville skjende henne, men falt da død om. Legenden forteller at Agnes vekket ham tilbake til livet. Det finnes også historier om at hun ble halshogd eller brent på bålet, eventuelt først prøvd brent, men da hun var uskadet, ble hun stukket med sverd i halsen.
Hodet ble fjernet fra Agnes' skrin og overført til Lateranpalasset rundt 800-tallet. Det ble undersøkt av arkeologer tidlig i det 20. århundret. Det antatte stedet for hennes henrettelse var keiser Domitians (81-96) stadion i Roma, kjent som Circus Agonalis, i dag Piazza Navona. Der står i dag kirken Sant'Agnese in Agone, som ble påbegynt av Carlo Rainaldi, videreført av Borromini fra 1653 og fullført av Rainaldi den yngre. Agnes' hode finnes i dag i Sant'Agnese in Agone, mens resten av relikviene er i Sant'Agnese fuori le Mura.
Et latinsk ordspill på Agnes' navn assosierer henne med agnus, lammet, også plettfritt og rent. Dette førte til at hennes attributt innenfor kunsten er et lam i tillegg til eller i stedet for martyrpalmen. Lammet ble hennes fremste emblem fra mosaikkene fra 500-tallet i Sant'Apollinare Nuovo i Ravenna og fremover. I Sant'Apollinare Nuovo avbildes hun blant de 22 jomfruene i mosaikken «Jomfruenes prosesjon».
Agnes' navn førte også til hennes tilknytning til lammeullen som brukes til å veve erkebiskopenes pallier, de hvite skulderbåndene med innsydde kors, som paven gir de nyutnevnte residerende erkebiskoper (metropolitter) som tegn på deres verdighet. Hvert år på Agnes' festdag 21. januar bringes to unge, hvite lam til kirken Sant'Agnese fuori le Mura ved Via Nomentana. Lammene kommer fra trappistmunkene ved klostret Tre Fontane i Roma. Lammene bringes frem mens koret synger antifonen Stans a dextris eius agnus nive candidior («Ved hennes høyre hånd et lam hvitere enn sne»). Deretter velsignes de og tas med tilbake til klosteret til de skal klippes. Av ullen vever nonnene ved Santa Cecilia-klosteret i Trastevere deretter palliene, som plasseres på alteret i Confessio i Peterskirken på vigilien for festdagen for apostelfyrstene Peter og Paulus 29. juni. I messen på festdagen deler paven ut palliene til de nye erkebiskopene.
Agnes fremstilles gjerne med langt hår, ofte med et sverd i halsen. Den eldste avbildningen av henne er i marmor og fra 300-tallet. Den ble funnet i 1818 og brakt til Sant'Agnese fuori le Mura. I gammel tid ba unge jenter til Agnes om råd til å velge seg en god ektemann. Opp til våre dager har det vært en utbredt tro at unge jenter natten før hennes festdag kunne se sin fremtidige mann i drømme hvis de hadde fastet på forhånd.
Hennes minnedag er 21. januar og hennes navn står i Martyrologium Romanum. Tidligere hadde den romerske kalenderen i tillegg en fest den 28. januar. Det menes å ha vært hennes egentlige dødsdag heller enn en oktavdag, mens 21. januar var dagen for hennes passio, da hun ble brakt for retten. I Utrecht feires en translasjonsfest den 2. september. Agnes nevnes i Canon Romanus eller Den romerske kanon (Eukaristisk bønn I) etter forvandlingen blant de syv kvinner som blir anropt som forbedere i strofen Nobis quoque (Felicitas og Perpetua, Agathe, Lucia, Agnes, Cecilia og Anastasia).